信帆生物提供：Western實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)，Western實(shí)驗(yàn)代做，歡迎大家！
實(shí)驗(yàn)步驟：
Western，也稱Western blot、Western Blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)：
使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。
亞細(xì)胞組分分離方法：(參考)
制備組織勻漿(根據(jù)組織類型選擇不同的勻漿方法，進(jìn)行優(yōu)化)
離心 時(shí)間 亞細(xì)胞組分
1,000g X 10 min pellets nuclei(細(xì)胞核)
heavy mitochondria(線立體)
plasma membrane sheets(漿膜)
3,000g X 10 min heavy mitochondria(線立體)
plasma membrane fragments(漿膜)
6,000g X 10 min Mitochondria(線立體)
Lysosomes(溶酶體)
Peroxisomes(過氧化物酶體)
intact Golgi(完整高爾基體)
10,000g X 10 min Mitochondria(線立體)
Lysosomes(溶酶體)
Peroxisomes(過氧化物酶體)
intact Golgi membranes(完整高爾基體膜)
20,000g X 10 min Lysosomes(溶酶體)
Peroxisomes(過氧化物酶體)
Golgi membranes(高爾基體膜)
large dense vesicles(大高密度囊泡)
100,000g X 10 min all vesicles from ER(來自內(nèi)質(zhì)望網(wǎng)的囊泡)
plasma membrane(漿膜)
Golgi(高爾基體)
Endosomes(內(nèi)含體)
注：以上方法僅做為參考，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。
2. 電泳(Electrophoresis)：
(1) SDS-PAGE凝膠配制(參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制)
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。
為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。
通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)：
(1)膜的選擇：推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。
硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較水浴加熱3-5分鐘，以充脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。
膜的使用請(qǐng)參考生物試劑商的推薦使用步驟。
(2) 分變性蛋白
電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。S
DS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，
(3) 轉(zhuǎn)膜時(shí)間
轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。
具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。
在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。
轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉(Blocking)：
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。
從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
對(duì)于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)：
參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用稀釋一抗。
吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。
回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通常可以選用Tubulin抗體或Actin抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)：
吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。
回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。
二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)。
7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)
參考相關(guān)說明書，使用ECL類試劑來檢測(cè)蛋白。
壓片可以采用的壓片暗盒進(jìn)行。
洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。
8.Western Blot問題解答
無顯色信號(hào)問題的原因分析：
1.裂解產(chǎn)物中抗原含量不足
a. 抗原無表達(dá)或表達(dá)量過少
b. 蛋白降解或上樣量不足
c. 裂解產(chǎn)物制備失誤
2.制膠濃度比例不合適。
3.轉(zhuǎn)膜不*
4.一抗稀釋濃度過大
5.二抗與一抗不匹配
6.顯色系統(tǒng)靈敏度不足
非特意性雜帶出現(xiàn)的原因分析：
1.封閉或清洗不*
2.一抗?jié)舛冗^高
3.蛋白降解
4.抗體與非特異性蛋白交叉反應(yīng)
5.蛋白間聚集作用，形成二具體
6.轉(zhuǎn)移膜使用不當(dāng)
7.操作過程中轉(zhuǎn)移膜干燥
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