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南京信帆生物:糖芯片分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
更新時(shí)間:2016-04-22   點(diǎn)擊次數(shù):1261次

生物通報(bào)道:細(xì)胞表面的由脂質(zhì)和蛋白組成的糖體分子蘊(yùn)藏著許多奧秘,決定了細(xì)胞如何發(fā)育,如何相互作用以及溝通。細(xì)菌和病毒也就是粘附在這些線性或帶分枝寡糖(glycan)上感染細(xì)胞的,免疫系統(tǒng)要進(jìn)行反擊,也需要首先學(xué)會(huì)識(shí)別微生物上的糖殼,展開先天和后天的防御。

經(jīng)過多年的探索,科學(xué)家們已經(jīng)掌握了不少糖體分子的基本生物學(xué)特征,但是比較于DNA和蛋白,我們對(duì)于這些分子的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,然而由于糖體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,要想構(gòu)建出這種分子非常困難,而且與DNA不同,糖體幾乎是不可能克隆和擴(kuò)增的,因此數(shù)量也是有限。

近年來一種用于分析遺傳物質(zhì)的新技術(shù)被證明適用于糖生物學(xué),這就是芯片技術(shù)。*個(gè)糖芯片誕生于2002年,也就是在芯片技術(shù)問世后,用于研究基因表達(dá)后的第7個(gè)年頭。

糖芯片由少量多種類的天然或合成的低聚糖組成,研究人員利用這種芯片能識(shí)別結(jié)合在糖上的蛋白,細(xì)胞和微生物。由于芯片制作只需要極少量的糖分子,因此這種技術(shù)得以能進(jìn)行蛋白糖親和性的廣泛篩選。

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目前有十幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建自己的糖芯片,隨著更多的糖分子被分離和合成出來,這些芯片將會(huì)不斷完善。目前制造生物試劑zui大及zui多糖芯片的是一個(gè)性的研究協(xié)會(huì):功能糖組學(xué)協(xié)會(huì)(Consortium for Functional Glycomics,CFG,生物通譯),以及英國(guó)倫敦帝國(guó)學(xué)院的糖科學(xué)實(shí)驗(yàn)室,其它一些實(shí)驗(yàn)室則主要是針對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行小規(guī)模的制作。

“在這一點(diǎn)上我認(rèn)為沒有什么單個(gè)平臺(tái)的贏家”美國(guó)國(guó)家癌癥研究所化學(xué)糖生物學(xué)組組長(zhǎng)Jeffrey Gildersleeve說。

由于RNA測(cè)序價(jià)格下降,DNA芯片已不再像以前那樣受到矚目,但糖芯片的未來卻被看好,“我認(rèn)為未來五年里,(糖芯片)就會(huì)開始商業(yè)化,進(jìn)入工業(yè)應(yīng)用和應(yīng)用領(lǐng)域,”埃默里大學(xué)醫(yī)學(xué)院功能糖組學(xué)國(guó)家中心(NCFG,生物通譯)主任Richard Cummings說。

糖芯片制備原理

糖芯片的制備原理與基因芯片,蛋白芯片相似,是將多種微量的糖類化合物以點(diǎn)陣的形式固定在某種材料制作的底片上,采用高通量掃描技術(shù)和熒光染色等手段分析和檢測(cè)糖分子與其它生物大分子之間的特異性結(jié)合,進(jìn)而研究其生物功能和作用機(jī)制。

糖芯片具有檢測(cè)樣品用量少,特異性高,高敏感性,高通量和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),的提高了糖化學(xué)研究的效率,這種芯片可以分成單糖或二糖芯片,寡糖芯片,多糖芯片和復(fù)合式芯片,另外根據(jù)用途不同也可以分成功能糖組學(xué)芯片,藥物開發(fā)糖體芯片和糖抗原免疫診斷芯片等。

制備糖芯片的方法有非化學(xué)修飾糖類固定和化學(xué)修飾糖類固定,前者通過點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣將糖直接固定在玻片上,屬于非特異性結(jié)合,這種方法無需對(duì)糖基進(jìn)行修飾。但是由于糖類化合物的性質(zhì),如分子量,空間結(jié)構(gòu),溶解性,反應(yīng)位點(diǎn)等都不同,因此有些糖類化合物無法直接以非共價(jià)結(jié)合的方式直接固定在固體介質(zhì)上,為此科學(xué)家們就需要對(duì)糖進(jìn)行化學(xué)修飾,即嫁接上能與載體表明產(chǎn)生特異性結(jié)合的基團(tuán),然后再固定。

糖芯片與其它技術(shù)的結(jié)合

糖芯片將糖分子通過共價(jià)或非共價(jià)作用固定于經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上, 進(jìn)而對(duì)糖蛋白等待測(cè)樣品或糖分子探針本身進(jìn)行測(cè)試、分析。與芯片上糖探針存在特異作用的樣品分子被吸附, 其他無特異作用的分子則在清洗液的沖洗下被洗掉。通過熒光染色等檢測(cè)方法可以簡(jiǎn)單、快速地篩選出存在特異作用的分子,從而在分析糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能等方面起到重要作用。

質(zhì)譜技術(shù)是目前糖生物學(xué)家應(yīng)用的測(cè)定糖鏈結(jié)構(gòu)的工具。快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、 電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)、基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行質(zhì)譜是在糖鏈結(jié)構(gòu)測(cè)定方面應(yīng)用廣泛的3種質(zhì)譜,它們可以直接對(duì)樣品進(jìn)行離子化和解析作用以獲得信息, 而且可以完整的糖復(fù)合物或片段化的樣品進(jìn)行分析。

在利用糖芯片的同時(shí), 可以聯(lián)合利用質(zhì)譜技術(shù), 來分析糖蛋白等待測(cè)樣品或糖分子探針的具體結(jié)構(gòu)。例如, 利用DNA芯片點(diǎn)樣儀將糖抗原點(diǎn)印在化學(xué)修飾的玻片上。然后把芯片與待測(cè)樣品溫浴, 此時(shí), 待測(cè)樣品中的配體就會(huì)與芯片上的糖分子結(jié)合, 而后用類 似于蛋白質(zhì)芯片中所用的免疫檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行染色分析, 如用抗體 ( 單抗或多抗血清 )或其他糖結(jié)合蛋白 (凝集素、 細(xì)胞因子等 )進(jìn)行免疫染色。經(jīng)抗體染色的玻片可以用生物芯片掃描儀檢測(cè)熒光信號(hào), 并借助于計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析, 得出有效的熒光信號(hào)。zui后, 在有效熒光信號(hào)所 對(duì)應(yīng)糖芯片的原位進(jìn)行質(zhì)譜分析, 分析其具體結(jié)構(gòu)。

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