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RT－PCR 已經(jīng)成為研究者確定感興趣的器官、組織或細(xì)胞中mRNA 轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的基本方法。RT－PCR的基本步驟包括：首先對(duì)樣品中出現(xiàn)的所有mRNA 合成一個(gè)cDNA拷貝，接著擴(kuò)增感興趣的基因。因?yàn)閮蓚€(gè)步驟中使用的反應(yīng)緩沖液不能兼容，所以這兩個(gè)步驟（RT 和PCR）通常分別進(jìn)行。即使有些試劑盒能將兩個(gè)步驟合而為一，但是同樣因?yàn)樯鲜龅木彌_液不兼容性，地限制了檢測(cè)靈敏度。Eppendorf 設(shè)計(jì)了一個(gè)含有全新化學(xué)物質(zhì)的新試劑盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在兩步法實(shí)驗(yàn)中可以獲得更高的靈敏度。

簡(jiǎn)介

    逆轉(zhuǎn)錄（RT）以及隨后進(jìn)行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術(shù)之一。如果需要平行分析多個(gè)RNA 樣品，方法為一步法RT－PCR。如果要擴(kuò)增困難目標(biāo)片段或從單一cDNA 池中擴(kuò)增多重目標(biāo)片段則會(huì)選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)適用于各種RT－PCR 應(yīng)用。它含有一種全新的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應(yīng)緩沖液能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無(wú)需優(yōu)化。這種自我調(diào)節(jié)的效果是通過(guò)對(duì)鎂離子的弱螯合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如果鎂離子濃度過(guò)高，螯合劑會(huì)與過(guò)剩的鎂離子結(jié)合，如果反應(yīng)（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會(huì)被釋放出來(lái)。這種創(chuàng)新技術(shù)提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進(jìn)行一步法，又能進(jìn)行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，能擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍也很大（一步法反應(yīng)zui長(zhǎng)可擴(kuò)增5.3 kb片段；兩步法方案zui長(zhǎng)能擴(kuò)增12.3 kb 片段）。

下面的實(shí)驗(yàn)可以展示該試劑盒在不同應(yīng)用中的表現(xiàn)。
    實(shí)驗(yàn)1關(guān)注新試劑盒在一步法RT－PCR 中的靈敏度。而在一步法應(yīng)用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標(biāo)材料進(jìn)行有效工作。

    實(shí)驗(yàn)2顯示應(yīng)用一步法方案進(jìn)行長(zhǎng)距離RT－PCR 不再是個(gè)難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時(shí)保證逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。

    本系統(tǒng)提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實(shí)驗(yàn)3描述了對(duì)不同模板的擴(kuò)增情況。這個(gè)新的系統(tǒng)能為所有的RT目標(biāo)提供全面解決方案，不論需要擴(kuò)增的片段是中等長(zhǎng)度還是極長(zhǎng)，不同來(lái)源的總RNA 中轉(zhuǎn)錄本是低豐度還是高豐度。

材料和方法

Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)1：一步法靈敏度檢測(cè)RT－PCR 
擴(kuò)增目標(biāo)：500 bp 的人α微管蛋白mRNA。
模板RNA：從人HELA細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應(yīng)總體積50μl
 循環(huán)參數(shù)：

結(jié)果

cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測(cè)到α微管蛋白mRNA。

實(shí)驗(yàn)2：一步法擴(kuò)增長(zhǎng)片段RT－PCR 

擴(kuò)增目標(biāo)：5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA&片段。
模板RNA：從人HELA 細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度為100ng和10ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對(duì)長(zhǎng)模板的特殊RT－PCR 方案。

設(shè)置一步法RT－PCR 反應(yīng)。

 循環(huán)程序參數(shù)

結(jié)果

如圖2 所示，應(yīng)用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測(cè)到5.3 kb 的hTSF PCR 產(chǎn)物。這個(gè)PCR 反應(yīng)非常困難，大多數(shù)RT－PCR 試劑盒生物試劑廠家從未發(fā)布過(guò)應(yīng)用一步法方案，有效擴(kuò)增類似長(zhǎng)度模板的結(jié)果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩(wěn)定可靠地從10 ng HELA 細(xì)胞RNA 中擴(kuò)增該產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)3：兩步法RT－PCR 

兩步法RT－PCR 的擴(kuò)增目標(biāo)：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA pian段
1.3kb 的（鼠和人）腫瘤壞死因子受體（TNFR1）mRNA pian段
5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA pian段
12.3 kb 的鼠動(dòng)力蛋白mRNA pian段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產(chǎn)品說(shuō)明書中的針對(duì)普通長(zhǎng)度模板和較長(zhǎng)模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物為引物。

設(shè)置*步RT 反應(yīng)

設(shè)置第二步PCR 反應(yīng)

RT反應(yīng)條件

注：動(dòng)力蛋白的逆轉(zhuǎn)錄孵育時(shí)間延長(zhǎng)至90 分鐘。

* —— 微管蛋白
** —— TNFR1

hTSF 和動(dòng)力蛋白的三步循環(huán)方案

不同大小目的片段所采用的延伸時(shí)間和退火溫度

 結(jié)果

對(duì)5 種不同表達(dá)水平的基因進(jìn)行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應(yīng)分開(kāi)進(jìn)行。如圖3 所示，對(duì)于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應(yīng)用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進(jìn)行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無(wú)論片段長(zhǎng)度大小和拷貝數(shù)高低，所有反應(yīng)都可以順利進(jìn)行。即使對(duì)于動(dòng)力蛋白這種特別長(zhǎng)（達(dá)12.3 kb）的稀有轉(zhuǎn)錄本，用cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)也能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增，而且結(jié)果具有的重復(fù)性，表明即使對(duì)于困難的RT－PCR 反應(yīng)， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結(jié)果。

  cMaster RT 系統(tǒng)是為了給所有的RT 和RT－PCR 應(yīng)用提供zui大的靈活性而設(shè)計(jì)的。該試劑盒結(jié)合了重組的同二聚體病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和*的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)，可以在較寬的溫度范圍（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb產(chǎn)物大小范圍內(nèi)進(jìn)行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應(yīng)用于一步法中，可以靈敏地檢測(cè)到極少量的總RNA 并擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)5.3 kb的cDNA（參見(jiàn)圖1 和圖2） 兩步法方案可以從RT 反應(yīng)中擴(kuò)增多個(gè)目的cDNA，PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度可增加至12.3 kb（參見(jiàn)圖3） 其他的擴(kuò)展應(yīng)用：系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統(tǒng)合用或者為其他下游應(yīng)用如雜交實(shí)驗(yàn)合成cDNA 探針。